c18反相色譜柱具有硅膠和聚苯乙烯色譜柱二者的優(yōu)點(diǎn)，并且摒棄了這兩種色譜柱的缺點(diǎn)。以乙烯醇共聚物為基質(zhì)的色譜柱，即使其載炭量很高也能保持表面的濕潤。多孔結(jié)構(gòu)具有足夠大的平均孔徑，對(duì)小分子化合物、多肽和小分子蛋白能夠產(chǎn)生理想的分離效果。在有機(jī)溶劑比例較高的流動(dòng)相中，該柱具有與硅膠基質(zhì)色譜柱相同的柱效，但在堿性緩沖溶液為流動(dòng)相條件下，其分離效率則超過硅膠色譜柱。顯著的特點(diǎn)之一是基質(zhì)被烷基化的填料的洗脫順序，其保留能力與碳鏈長度成正比。

　　c18反相色譜柱的活化步驟：

　　1、應(yīng)先使用20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱；

　　2、若流動(dòng)相含有緩沖鹽，用跟流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗過渡。用量為20倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；

　　3、若流動(dòng)相不含緩沖鹽，用流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；

　　4、到壓力基線平穩(wěn)，若不平穩(wěn)可延長平衡時(shí)間。

　　優(yōu)化反相色譜柱的條件：

　　在確定了色譜柱規(guī)格、合適的固定相柱填料、流動(dòng)相溶劑和改性劑后，即可開始優(yōu)化方法，方法的優(yōu)化是根據(jù)目標(biāo)決定的，如果要開發(fā)質(zhì)量控制方法，您可能會(huì)需要像等度分離這種可變因素較少的方法。如果目標(biāo)是得到較高分離度，節(jié)省分析時(shí)間并不是首要問題，可以選擇長柱使所有組分都得到較大分離度。如果分離速度很重要，則應(yīng)使用短柱和高流速。對(duì)于含許多保留不同的目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，用等度分離可能不能解決問題，應(yīng)開發(fā)并優(yōu)化梯度方法。

　　按約定俗成將水相溶劑和反相色譜中較弱的溶劑稱為流動(dòng)相“A”，“B”溶劑是有相組成較高和較強(qiáng)的溶劑。c18反相色譜柱在反相色譜模式中，當(dāng)增加B的百分比時(shí)，通常保留將減少。請(qǐng)注意，在還沒有開發(fā)出樣品的實(shí)際分析方法前，大部分人開發(fā)HPLC方法都是采用“反復(fù)實(shí)驗(yàn)”的方法，即，嘗試各種不同流動(dòng)相條件，以找出較佳條件。